【研究意義】空心蓮子草［Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb.］是一種惡性外來入侵植物，其主要入侵地有河流、沼澤、池塘、菜地和農(nóng)田等水生和陸地環(huán)境，對(duì)入侵地的生態(tài)系統(tǒng)具有嚴(yán)重的負(fù)面影響[1-2]。空心蓮子草主要通過地上部的匍匐莖和地下莖進(jìn)行無性繁殖，具有超強(qiáng)的無性繁殖能力[3-4]。在水體中漂浮生長(zhǎng)的時(shí)候，其匍匐莖節(jié)部可產(chǎn)生大量不定根，然而，當(dāng)空心蓮子草匍匐莖的不定根有機(jī)會(huì)接觸到土壤后，其不定根在土壤中可進(jìn)行不同程度的膨大生長(zhǎng)，形成貯藏根[5]，這種貯藏根是陸生型空心蓮子草越冬、繁殖和種群擴(kuò)散的重要保障[6-7]。可見空心蓮子草的根系構(gòu)型隨環(huán)境條件的變化而變化，研究空心蓮子草根系生長(zhǎng)發(fā)育，尤其是貯藏根的發(fā)育，對(duì)于揭示空心蓮子草成功入侵的機(jī)制具有重要作用[8-9]。【前人研究進(jìn)展】近年來對(duì)空心蓮子草根系的研究，主要采用莖段扦插盆栽育苗的方法，例如對(duì)根系生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的研究[6]、環(huán)境條件尤其是水分狀況對(duì)根系發(fā)生的影響[8]、外源激素施用對(duì)貯藏根生長(zhǎng)的研究[10]等，莖段扦插盆栽育苗能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得相對(duì)均勻一致的空心蓮子草幼苗，為開展系列控制實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】莖段扦插試驗(yàn)存在局限性，例如，難以直接觀察植物根系生長(zhǎng)情況，在試驗(yàn)中可能受到病蟲害和邊緣效應(yīng)的影響等。【擬解決的關(guān)鍵問題】Shekhawat 等[11]使用組織培養(yǎng)方法研究了空心蓮子草大規(guī)模繁殖技術(shù)，主要為開展藥用化學(xué)物質(zhì)提取做準(zhǔn)備，但其操作復(fù)雜，成本較高。本文試圖利用組織培養(yǎng)體系，尋求一種操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)有效的空心蓮子草莖段組織培養(yǎng)方法，對(duì)其根系發(fā)育情況進(jìn)行研究，為揭示空心蓮子草的入侵機(jī)制和開展入侵防控提供基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
于 2019 年 12 月 23 號(hào)，在荊州市西郊田間溝渠采集長(zhǎng)約 4 cm 生長(zhǎng)健壯的空心蓮子草的帶節(jié)莖段，去葉，清洗干凈用流水沖洗 30 min 后，使用體積分?jǐn)?shù) 75%酒精震蕩沖洗 1 min，再用 0.1%升汞進(jìn)行震蕩沖洗 6 min 消毒，最后用無菌水沖洗 5 遍，每次沖洗 1 min，使用 MS 培養(yǎng)基進(jìn)行接種。待外植體萌出1~2 cm 的新枝后，將帶節(jié)新枝切下并接入 MS 培養(yǎng)基，此為第 1 代無菌苗；待無菌苗長(zhǎng)出 3 節(jié)以上后，切成帶一節(jié)的含葉莖段接入培養(yǎng)基，此帶一節(jié)的莖段長(zhǎng)成的無菌苗為第 2 代，依次進(jìn)行，本試驗(yàn)使用第3 代無菌苗作為組培試驗(yàn)材料。
1.2 試驗(yàn)處理
試驗(yàn)設(shè)計(jì)考慮了多種因素，按單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。首先降低 MS 培養(yǎng)基中鉀離子濃度（降至標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基 60%，含硝酸銨 1 971 mg/L，硝酸鉀 1 090 mg/L），培養(yǎng)基的凝固劑分別使用卡拉膠 3 g/L 和普通瓊脂 8 g/L；外植體莖段分帶節(jié)和不帶節(jié)處理，不帶節(jié)處理中外植體長(zhǎng)為 2 cm，接種深度為 0.9 cm 左右；帶節(jié)外植體的節(jié)下部分設(shè)置 3 種長(zhǎng)度，為 1.5，0.5，0.1 cm，接入培養(yǎng)基的深度分別為 1.4，0.4，0.1 cm；外植體莖段分別進(jìn)行芽朝上或芽朝下（正插和倒插）方式進(jìn)行接種；節(jié)下部分長(zhǎng)度為 1.5 cm 的外植體接入培養(yǎng)基的深度設(shè)置 3 種處理，為 0.4，0.9，1.4 cm。實(shí)驗(yàn)所用的器皿為試管(長(zhǎng) 23 cm，直徑為 3 cm，容積 100 mL)，每支試管均含培養(yǎng)基約 60 mL 左右，外植體的節(jié)上部分長(zhǎng)度均為 1 cm，節(jié)間直徑為 0.15 cm左右，去掉葉片后保持垂直或略帶傾斜接入培養(yǎng)基，每支試管接入外植體（扦插）一個(gè)，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，光照時(shí)長(zhǎng) 14 h，外植體的地上部分的光照強(qiáng)度為 1 600~1 800 lx，地下部分（根系生長(zhǎng)部分用泡沫紙板進(jìn)行遮光）的光照強(qiáng)度為 270 lx 左右。實(shí)驗(yàn)共 9 個(gè)處理，每個(gè)處理共 10 個(gè)重復(fù)，共培養(yǎng) 9×10=90個(gè)植株。
1.3 測(cè)量方法與數(shù)據(jù)分析
1.3.1 根系形態(tài)分析 在空心蓮子草的外植體生長(zhǎng) 70 d 進(jìn)行取樣，根據(jù)外植體的成活情況，每個(gè)處理取樣數(shù)為 5 株，其余外植體繼續(xù)培養(yǎng)觀察。每株空心蓮子草從試管中取出并洗凈后，統(tǒng)計(jì)空心蓮子草節(jié)間和節(jié)處的生根情況（總生根數(shù)和直徑≥0.15 mm 的根數(shù)）和葉片數(shù)（葉片長(zhǎng)度≥0.5 cm 的片數(shù)），使用游標(biāo)卡尺（精度 0.01 mm）測(cè)量直徑≥0.15 mm 不定根最大橫徑處的直徑、莖段的直徑（側(cè)莖由下向上第 4 至第 5 節(jié)處節(jié)間的橫徑）和長(zhǎng)度。使用
萬(wàn)深 LA-S 根系分析獨(dú)立版植物根系分析儀對(duì)根系進(jìn)行掃描，測(cè)量的指標(biāo)包括節(jié)處不定根系的總長(zhǎng)度、總體積和總表面積，節(jié)間處的不定根的總長(zhǎng)度、總體積和總表面積。最后，將每株植株分成莖葉和根分別放入 GZX-9140 烘箱中，80 ℃下烘干至恒質(zhì)量（48 h），用電子天平（METTLER TOLEDO PL303-IC（精度 0.001））分別稱量地上莖葉干質(zhì)量、根系干質(zhì)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用 WPS 和 SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析，利用單因素分析法（one-way ANOVA）法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 空心蓮子草匍匐莖段萌發(fā)情況
絕大多數(shù)的外植體的萌動(dòng)順序?yàn)閭?cè)芽萌發(fā)、節(jié)間處產(chǎn)生不定根、節(jié)處產(chǎn)生不定根，少許外植體側(cè)芽萌動(dòng)后，先節(jié)處產(chǎn)生不定根后節(jié)間處產(chǎn)生不定根。除 A4 處理外，其他處理的空心蓮子草莖段（外植體）的節(jié)部均能產(chǎn)生不定根；除 A3 和 A6 處理外，其它處理的外植體節(jié)下部的節(jié)間處（以下統(tǒng)稱節(jié)間）均可生長(zhǎng)出不定根（圖 1），但生長(zhǎng) 20~25 d 后，觀察到許多不定根尖端變黑，并停止伸長(zhǎng)。外植體節(jié)部、節(jié)間及截口處均沒有產(chǎn)生愈傷組織，絕大多數(shù)的外植體節(jié)上部逐漸枯萎。可見，在組培條件下，空心蓮子草匍匐莖段能夠成功萌發(fā)植株。
2.2 不同凝固劑對(duì)空心蓮子草生長(zhǎng)情況的影響
用瓊脂作為凝固劑，空心蓮子草的不定根總數(shù)、節(jié)部不定根數(shù)、節(jié)間處的不定根數(shù)顯著高于卡拉膠凝固劑處理（P<0.05），而根冠比則顯著降低（p<0.05）。瓊脂凝固劑處理中空心蓮子草地上葉片數(shù)、莖段長(zhǎng)度、地上干質(zhì)量高于卡拉膠處理，但差異不顯著（P>0.05）（表2）。瓊脂處理中節(jié)間處的不定根有膨大現(xiàn)象發(fā)生。這表明，瓊脂凝固劑有利于空心蓮子草不定根發(fā)生，并且有利于誘導(dǎo)不定根的膨大。
2.3 外植體的接種方向?qū)招纳徸硬萆L(zhǎng)情況的影響
空心蓮子草莖段無論正插還是倒插在培養(yǎng)基上，莖段均能生出側(cè)芽和不定根。倒插方式的外植體節(jié)間處沒有不定根發(fā)生，僅節(jié)處能產(chǎn)生不定根，其根系干質(zhì)量平均為（0.004 7±0.001 6）g/株，顯著低于正插的空心蓮子草根系干質(zhì)量（0.006 6±0.000 4）g/株（P<0.05）。2 種接種方式對(duì)實(shí)驗(yàn)中其余指標(biāo)沒有顯著差異（P>0.05）。這表明在組培體系中空心蓮子草莖段萌發(fā)對(duì)極性不存在依賴性。
2.4 外植體節(jié)下部分莖段的長(zhǎng)度對(duì)空心蓮子草生長(zhǎng)的影響
外植體節(jié)下長(zhǎng) 1.5 cm 處理（A7）的不定根總數(shù)、節(jié)部不定根總長(zhǎng)度和總表面積、節(jié)間處不定根的總體積、根系干質(zhì)量、葉片數(shù)、莖葉干質(zhì)量、匍匐莖直徑和長(zhǎng)度都顯著高于其他處理（P<0.05），這些指標(biāo)隨著外植體節(jié)下部分莖段長(zhǎng)度的增加呈現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)。外植體節(jié)下部莖段長(zhǎng) 0.1 cm 時(shí)，節(jié)間處不發(fā)生不定根；外植體節(jié)下部莖段長(zhǎng) 0.5，1，1.5 cm 處理中，節(jié)間處不定根的總體積存在顯著差異（P<0.05），但在數(shù)量上沒有顯著差異（P>0.05）（表 3)，節(jié)間處不定根沒有發(fā)現(xiàn)膨大現(xiàn)象。由此可見，空心蓮子草節(jié)下部分長(zhǎng)度對(duì)其根系和莖葉部分生長(zhǎng)具有重要影響。
2.5 外植體節(jié)下部分的扦插深度對(duì)空心蓮子草的生長(zhǎng)影響
節(jié)下部長(zhǎng)度為 1.5 cm 的外植體，當(dāng)接入培養(yǎng)基的深度為 1.4 cm 的時(shí)候（A7），節(jié)部不定根總長(zhǎng)度和總表面積、根系干質(zhì)量、葉片數(shù)、莖葉干質(zhì)量、匍匐莖的直徑和長(zhǎng)度顯著高于接種深度為 0.5 cm 處理（A9）（P<0.05），而根冠比則顯著降低（p<0.05）（表 4）。這說明，空心蓮子草外植體扦插深度較深時(shí)，有利于其根系和地上部分生長(zhǎng)。
當(dāng)外植體繼續(xù)生長(zhǎng)的 80 d 后，即實(shí)驗(yàn)處理 150 d 后觀察，發(fā)現(xiàn)外植體生出的側(cè)枝上的節(jié)間也會(huì)產(chǎn)生不定根，不定根出現(xiàn)明顯的膨大現(xiàn)象（圖 2A），在接種深度為 0.5 cm 的處理中（A9），外植體節(jié)部和節(jié)間處產(chǎn)生的不定根均具有明顯的膨大現(xiàn)象（圖 2B）。
3 討論與結(jié)論
綜上所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，空心蓮子草莖段比較理想的組培條件為：帶 1 節(jié)長(zhǎng)度為 4 cm 的去葉空心蓮子草莖段，使用體積分?jǐn)?shù) 75%酒精浸泡 1 min，0.1%升汞浸泡 6 min 消毒，在 MS 培養(yǎng)基中連續(xù)繼代培養(yǎng)，采用第 3 代無菌苗的莖段作為外植體，在含有普通瓊脂的 MS 培養(yǎng)基（鉀離子濃度降至標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基 60%，含硝酸銨 1 971 mg/L，硝酸鉀 1 090 mg/L）條件下，節(jié)下部長(zhǎng)度為 1.5 cm 帶節(jié)外植體正向扦插深度為 1.4 cm時(shí)，可以獲得生長(zhǎng)良好的空心蓮子草植株。
已有文獻(xiàn)[6,12-13]認(rèn)為，空心蓮子草莖段不定根是從節(jié)部發(fā)出，實(shí)驗(yàn)中，除外植體的節(jié)下部莖段長(zhǎng)度為 0.1 cm 和培養(yǎng)基中外植體接種方向?yàn)榈共逄幚硗猓渌幚碇芯l(fā)現(xiàn)外植體的下部截口上方的莖段能夠不經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)直接生長(zhǎng)出不定根，即出現(xiàn)節(jié)間生根現(xiàn)象，節(jié)間生根一般早于節(jié)部生根。這表明空心蓮子草莖段在組培條件下，具有較強(qiáng)的生根能力，不定根發(fā)生部位比較廣泛。
外植體培養(yǎng) 70 d，發(fā)現(xiàn)有部分不定根出現(xiàn)膨大趨勢(shì)。繼續(xù)培養(yǎng) 80 d（共 150 d），筆者觀察到空心蓮子草不定根出現(xiàn)明顯膨大。這說明組培條件下，空心蓮子草具有膨大形成貯藏根的能力。因此，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了研究空心蓮子草莖段不定根膨大的組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步在組培條件下開展空心蓮子草貯藏根的形成機(jī)理提供依據(jù)。
植物的根系生長(zhǎng)會(huì)受到內(nèi)源激素的影響。內(nèi)源激素主要由植物的根尖、莖尖和種子等組織進(jìn)行合成，存在從頂部向基部的極性運(yùn)輸情況[14]，有研究[15]表明植物的莖段中也存在內(nèi)源激素。在實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到外植體的側(cè)芽先伸出，然后再產(chǎn)生不定根；倒插時(shí)節(jié)間發(fā)生不定根，不帶節(jié)外植體的節(jié)間處也能生出不定根。 這些現(xiàn)象可能與內(nèi)源激素存在一定關(guān)系。空心蓮子草幼莖的莖尖能夠合成內(nèi)源激素并將其進(jìn)行極性運(yùn)輸促使外植體節(jié)下部莖段生出不定根，除此之外，空心蓮子草的不帶節(jié)莖段中可能也含有內(nèi)源激素，從而誘導(dǎo)空心蓮子草的節(jié)間和節(jié)處能夠發(fā)生不定根。
在盆栽育苗實(shí)驗(yàn)中，Dong 等[16-17]認(rèn)為空心蓮子草節(jié)間長(zhǎng)度的增加顯著提高了植株的存活率且有利于地上部分的生長(zhǎng)（生物量、莖長(zhǎng)和葉片數(shù)）。組培條件下，也發(fā)現(xiàn)外植體節(jié)下部長(zhǎng)度能顯著影響幼苗的生長(zhǎng)。一定范圍內(nèi)，節(jié)下部越長(zhǎng)，越有利于空心蓮子草幼苗的生長(zhǎng)。其原因可能是空心蓮子草莖段也是一個(gè)重要的貯藏器官[17-18]，可以儲(chǔ)存可溶性碳水化合物和蛋白質(zhì)[19-20]等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于幼苗的生長(zhǎng)。
空心蓮子草在組培實(shí)驗(yàn)上的成功有助于進(jìn)一步對(duì)其從生理方向進(jìn)行研究。筆者發(fā)現(xiàn)節(jié)間處生根現(xiàn)象在空心蓮子草中較為普遍，這一發(fā)現(xiàn)有助于揭曉空心蓮子草的入侵機(jī)理，在日后的防治中能夠更加精準(zhǔn)地對(duì)其進(jìn)行防控。
原文引用
郭雅琪, 姚振, 陳中義. 組培條件下空心蓮子草匍匐莖段根系發(fā)育的研究[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(2): 212-218.